Alan: İleri biyokimya · Düzey: İleri IBO
Michaelis–Menten'in ötesi
Bir enzim veya bağlanma proteini birden fazla ligandı karşılıklı etkileşimlerle bağlayabiliyorsa bağlanma eğrisi basit hiperbolik davranıştan ayrılabilir. Pozitif kooperativitede ilk ligand bağlanması sonraki bağlanmayı kolaylaştırabilir; negatif kooperativitede zorlaştırabilir. Bununla birlikte sigmoidal bir eğri tek başına bütün alt birimlerin aynı şekilde etkileştiğinin kanıtı değildir. Monod–Wyman–Changeux modelinde farklı konformasyon durumları, Koshland–Némethy–Filmer modelinde sıralı konformasyon değişimleri ele alınır. Bu modellerin varsayımları ve veri kapsamı karşılaştırılmalıdır.
Hill yaklaşımı bağlanma doygunluğunu θ=[L]n/(K0,5n+[L]n) gibi fenomenolojik olarak ifade edebilir. Hill katsayısı n_H, kooperativitenin ampirik göstergesi olabilir; n_H her koşulda fiziksel alt birim sayısına eşit değildir. Hemoglobin tetrameriktir fakat deneysel Hill katsayısı koşullara göre dört olmak zorunda değildir. Denge bağlanma eğrisinden katalitik hız mekanizmasını doğrudan çıkarmak da hatalıdır.
Özgün veri ve çıkarım
Bir proteinde ligand derişimi 1, 2, 4, 8 birim olduğunda satürasyon sırasıyla yaklaşık %6, %20, %50, %80 olarak ölçülsün. Bu aralık, sigmoidal bir davranışla uyumlu olabilir; ancak sistematik ölçüm hataları, heterojen bağlanma bölgeleri ve ligandın kullanılabilir fraksiyonu kontrol edilmeden kesin mekanizma söylenemez. Bu modelde K0,5=4 derişim birimidir. Hill çiziminde log[θ/(1−θ)] ile log[L] karşılaştırılır. [L]=2 ve 8 birim için θ=%20 ve %80 ise doygunluk oranları 0,25 ve 4 olur. İki noktadan Hill eğimi log(4/0,25)/log(8/2)=2 bulunur. Bu, basit verinin eğim tahminidir ve bağlanma bölgelerinin sayısını belirlemez.
Özgün IBO sorusu: Hill katsayısı 2,1 bulunan bir protein için hangisi savunulabilir? A) Protein kesin iki alt birimlidir B) Pozitif kooperatif davranışla uyumludur C) kcat 2,1 s⁻¹'dir D) Km yoktur E) Proteinin dört alt birim taşımadığı kanıtlanır. Yanıt B.
Deney stratejisi: Ligand bağlanma testi ile ürün oluşumuna dayalı enzim aktivitesi testini ayırmak gerekir. Farklı protein konsantrasyonlarında ölçümler, agregasyon olasılığını sınamaya yardımcı olur.
Kaynak: OpenStax Biology 2e, Proteins ve Enzymes: https://openstax.org/books/biology-2e/pages/6-5-enzymes
Katı kontrol sonrası derinleştirme
Hill eğimi ve kooperativitenin mekanistik sınırı
Hill eşitliği, tepkime eğrisinin belirli bölümündeki eğimi özetlemek için kullanılabilir; Hill katsayısının her durumda fiziksel bağlanma bölgesi sayısına eşit olduğu söylenemez. Birden fazla etken, örneğin reseptör heterojenliği, sinyal amplifikasyonu veya geri besleme, gözlenen eğimi değiştirebilir. Homojen bağlanma modellerindeki kooperatiflik, alt birimler arası allosterik etkileşimlerle açıklanabilir; ancak işlevsel yanıt eğrisinden bağlanma termodinamiği doğrudan çıkarılamaz.
İki sistemin EC₅₀ değerlerini karşılaştırırken reseptör sayısı, etken madde konsantrasyonunun serbest fraksiyonu, ölçülen sonlanım ve sistemin bazal düzeyi aynı tutulmalıdır. EC₅₀, denge ayrışma sabiti Kd ile otomatik eşit değildir. Özellikle reseptör rezervi bulunan sistemlerde düşük reseptör doluluğu güçlü yanıt oluşturabilir. Bir bağlanma deneyiyle yanıt deneyi birlikte yapılmadıkça yalnız yanıt eğrisinden mikroskobik afinitenin kesinleştiği söylenemez.
Yorum sorusu: Hill eğimi 2,0 ise tam iki fiziksel bağlanma bölgesi kesin vardır denebilir mi? Yanıt: Hayır.