Alan: Mikrobiyoloji · Düzey: İleri IBO
Büyümenin ölçümü
Bakteri kültürlerinde optik yoğunluk (OD), canlı olmayan hücreleri ve partikülleri de içerebilen bir bulanıklık göstergesidir; doğrudan canlı hücre sayısı değildir. CFU yöntemi, uygun besiyeri ve inkübasyon koşullarında koloni oluşturabilen birimlerin sayısını tahmin eder. Bir koloni tek hücreden veya hücre kümesinden kaynaklanabilir. Log fazda belirli koşullarda N(t)=N₀e^(µt) ve jenerasyon süresi g=ln2/µ yazılır. Besin tükenmesi, metabolit birikimi veya oksijen gradyanı büyüme eğrisini değiştirir.
Özgün hesap
10⁻⁵ seyreltmeden 0,1 mL ekilip 80 koloni sayılmış olsun. Ana kültürde tahmini yoğunluk 80/(10⁻⁵×0,1)=8×10⁷ CFU/mL'dir. Bu değer canlı tekil hücre/mL ile birebir eşit değildir; hücre kümeleri ve büyüyemeyen hücreler sonucu etkiler. Güvenilir tahminde uygun koloni sayısı aralığı, farklı seyreltiler ve bağımsız tekrarlar kullanılır.
Yatay gen aktarımı
Transformasyon çevreden DNA alınması; transdüksiyon faj aracılı aktarım; konjugasyon çoğunlukla hücreler arası temasla DNA transferidir. Her plazmitin mutlaka konjugatif olduğu söylenemez. Antibiyotik direnç genlerinin sıklığı, yatay aktarım, seçilim ve klonal çoğalma gibi süreçlerle değişebilir. Yalnız direnç fenotipinin görülmesi hangi yolun işlediğini kanıtlamaz.
Özgün soru: OD artışı gözlenirken CFU sayısı düşüyorsa hangisi olasıdır? A) OD yalnız DNA'yı ölçer B) Hücreler parçalanmadan canlılıklarını yitiriyor olabilir C) Her hücre iki kat çoğalır D) Optik ölçüm daima hatasızdır E) Kontaminasyon imkânsızdır. Yanıt B. Optik yoğunluk canlı sayımının eşdeğeri değildir.
Kaynak: OpenStax Microbiology (OpenStax kaynak sayfası): https://openstax.org/details/books/microbiology
Katı kontrol sonrası derinleştirme
CFU sayımında örnekleme hatası ve büyüme modeli
CFU, ekim koşullarında koloni oluşturabilen birimleri sayar; tek tek bütün canlı hücrelerin doğrudan sayımı değildir. Bir koloni bir hücreden veya hücre kümesinden kaynaklanabilir. Örneğin 10⁻⁵ seyreltilmiş kültürün 0,10 mL'sinden 85 koloni elde edilirse başlangıç derişimi yaklaşık 85/(10⁻⁵×0,10)=8,5×10⁷ CFU/mL olur. Bu hesap pipetleme ve homojen karışım varsayımlarına dayanır; değişkenlik için bağımsız ekim ve biyolojik tekrarlar gerekir.
Bakteriyel büyüme eğrisinde optik yoğunluk (OD), canlılıkla özdeş değildir: ölü hücreler ve hücresel parçacıklar da ışığı saçabilir. Bu nedenle OD'den CFU'ya dönüşüm kalibrasyon gerektirir. Antibiyotikle muamele sonrası OD'nin sabit kalması çoğalmanın kesin durduğunu veya tüm hücrelerin öldüğünü göstermez. Ölçümler sıcaklık, ortam, çalkalama ve hücre kümelenmesi açısından denetlenmelidir.
Yorum sorusu: OD değeri değişmeden CFU düşebilir mi? Yanıt: Evet; hücre canlılığı azalırken ışık saçan toplam biyokütle kısa sürede sabit kalabilir.