Alan: Biyokimya / laboratuvar yöntemleri | Beceri: Saflık, toplam etkinlik ve özgül etkinliği birlikte yorumlamak
Saflaştırmanın fiziksel temeli
Bir hücre lizatı binlerce proteini, nükleik asit parçalarını ve küçük metabolitleri içerir. Bir hedef proteinin saflığını artırmak için çözünürlük, elektriksel yük, hidrodinamik boyut, hidrofobiklik ve seçici ligand bağlanması gibi farklı özelliklerden yararlanılır. Amonyum sülfatla çöktürme bir proteini doğrudan tanımlamaz; çözünürlük aralıklarına göre zenginleştirir. İyon değişim kromatografisinde reçinenin yükü ile proteinin deney pH'sındaki net yükü belirleyicidir. Bir proteinin izoelektrik noktasının üstünde net negatif olma eğilimi, anyon değiştiriciye bağlanma olasılığını artırır; ancak yüzey yüklerinin dağılımı ve tampon bileşimi de önemlidir. Tuz gradyanı, elektrostatik etkileşimleri zayıflatarak farklı bağlanma kuvvetine sahip proteinleri ayırır.
Boyut dışlama kromatografisinde ideal koşullarda daha büyük hidrodinamik yarıçaplı kompleksler gözeneklere daha az girer ve daha erken elüe olur; bu, SDS-PAGE'deki küçük alt birimlerin daha hızlı ilerlemesiyle karıştırılmamalıdır. Affinite kromatografisi seçici bağlanmaya dayanır fakat hedef dışı proteinler de reçineye tutunabilir. İmmünaffinite veya His-etiketi saflaştırmasında uygun negatif kontrol ve etiket koparma deneyi gerekebilir.
Aktivite, verim ve saflık
Toplam etkinlik birimi U çoğu enzim testi için belirlenmiş koşullarda dakikada 1 µmol substrat dönüşümünü ifade eder. Özgül etkinlik U/mg, toplam etkinliğin toplam protein miktarına bölünmesiyle hesaplanır; saflaştırma katsayısı son özgül etkinlik / başlangıç özgül etkinlik; verim son toplam etkinlik / başlangıç toplam etkinlik ×100'dür. Her adımda saflık artarken toplam etkinliğin bir bölümü kaybolabilir. Özgül etkinliğin yükselmesi her zaman mutlak kimyasal saflık kanıtı değildir: inhibitörün uzaklaştırılması veya aktivatörün gelmesi de sonucu etkileyebilir.
SDS-PAGE çoğunlukla denatüre alt birimlerin görünür molekül kütlelerini ayırır. Natif PAGE ve boyut dışlama kompleksin oligomer durumuna dair ek bilgi verebilir; glukozilasyon veya proteoliz görünür bantları değiştirebilir. Kütle spektrometrisi peptit kimliklerini destekler; tek bant, eşsiz protein veya tam saflık anlamına gelmeyebilir.
Hesaplamalı örnek
Ham lizatta 800 mg toplam protein ve 4.000 U etkinlik vardır: özgül etkinlik 5 U/mg. Son fraksiyonda 25 mg protein ve 2.000 U bulunuyor: özgül etkinlik 80 U/mg; saflaştırma 16 kat, verim %50. Son fraksiyonun toplam etkinliği daha düşük olsa da her mg protein başına etkinliği yükselmiştir. İki ölçüm aynı pH, substrat derişimi ve sıcaklıkta yapılmalıdır; aksi halde yüzdeler doğrudan karşılaştırılamaz.
Deneysel muhakeme ve istisnalar
Enzimin kofaktörü ilk aşamalarda kaybolursa saflaştırma artmasına rağmen etkinlik düşebilir. Rekombinant proteinin etiketi bağlanmayı değiştirebilir. Enzim hızı substratın kaybolmasından hesaplanıyorsa substratı tüketebilen başka tepkimeler, kendiliğinden bozunma ve ölçüm arka planı kontrol edilmelidir. Hız ürün birikiminden hesaplanıyorsa ürünü tüketen yan tepkimeler görünür hızı düşürebilir. Teknik tekrarı olan üç kuyu, farklı günlerde hazırlanmış üç biyolojik örneğe eşdeğer değildir. Aktivite sonuçları doygun substrat koşullarında belirlenmezse fraksiyonlar farklı görünür Km değerleri nedeniyle yanlış sıralanabilir.
IBO problemi ve çözüm
A fraksiyonu 40 mg protein ve 1.200 U, B fraksiyonu 20 mg protein ve 1.000 U içeriyor. Hangisi doğrudur? A) B'nin toplam etkinliği daha yüksektir. B) B'nin özgül etkinliği 50 U/mg'dır ve A'nınkinden yüksektir. C) B kesin tek proteindir. D) A'nın özgül etkinliği 50 U/mg'dır. E) Protein miktarı olmadan özgül etkinlik bulunamaz.
Yanıt B. A=1.200/40=30 U/mg; B=1.000/20=50 U/mg. B'nin saflığının daha iyi olabileceği desteklenir ama saflık tek başına kesinlenmez. İkinci basamak: B'de toplam etkinlik A'nın %83,3'üdür; artan özgül etkinliğe eşlik eden kayıp beklenebilir.
Kaynak çerçevesi: Lehninger, Principles of Biochemistry; OpenStax, Biology 2e; yerleşik protein biyokimyası laboratuvar ilkeleri.
Bu notta yer alan veriler eğitim amacıyla kurgulanmıştır. Resmî IBO materyali değildir; bilimsel kaynak ve görsel açıklamaları için kaynaklar sayfasına bakınız.