Alan: Hücre biyolojisi · Düzey: İleri IBO
Ribozomun katalitik çekirdeği
Ribozom mRNA kodonlarını tRNA antikodonlarıyla eşleştirir. Aminoasil-tRNA sentetazları amino asitlerin doğru tRNA'ya bağlanmasında belirleyici seçicilik adımıdır; yanlış yükleme çeviri hatasına yol açabilir. Peptidil transferaz etkinliğinin ana katalitik bileşeni büyük ribozomal alt birimdeki rRNA'dır; bu nedenle ribozom bir ribozim özelliği taşır. Protein sentezi N ucundan C ucuna ilerler. Uzama sırasında GTP tüketen faktörler doğruluğu ve yönlülüğü destekler. Stop kodonları amino asit taşıyan tRNA'larca değil, salıverme faktörlerince tanınır (özel yeniden kodlama istisnaları vardır).
Salgı yoluna yönlendirme
N-terminal hidrofobik sinyal dizisi ribozomdan çıkınca sinyal tanıma partikülü (SRP) tarafından bağlanabilir; ribozom–mRNA kompleksi ER zarındaki SRP reseptörü ve Sec61 translokonu üzerinden kaba ER'ye yönlendirilir. Sentez sürerken polipeptit ER lümenine aktarılabilir veya zar proteini olarak yerleştirilebilir. ER lümenindeki proteinlerin katlanması ve bazı N-bağlı glukozilasyon adımları kalite kontrolünde önemlidir. Yanlış katlanan proteinler ERAD yoluyla sitozole geri çıkarılıp proteazoma yönlendirilebilir. Golgi'de glukozilasyonun düzenlenmesi ve lizozoma yönelik mannoz-6-fosfat işaretlemesi gibi işaretler, ürünün hedefini etkiler.
İstisna: Bütün proteinlerin sentezi ER'ye bağlı ribozomlarda gerçekleşmez. Sitozolik, nükleer ve pek çok mitokondriyal protein serbest ribozomlarda başlayarak ayrı hedefleme sinyalleriyle uygun bölmeye taşınır. Serbest ve ER'ye bağlı ribozomlar ayrı kalıcı ribozom türleri değildir; hedeflenecek polipeptide göre yer değiştirirler.
Pulse–chase deney tasarımı
Salgılanan glikoprotein kısa süre işaretlenip işaretli amino asidin bulunmadığı ortama alınır. ER → Golgi → hücre dışı sıralamasını izlemek için zaman serisi alınır. Brefeldin A veya ER çıkışını bozan bir mutasyon, Golgi'ye geçişi sınırlandırabilir; ancak ilacın yan etkileri ve organel bütünlüğü kontrol edilmelidir. Yüksek mannozlu bazı N-glikanlar Endo H ile kesilir. Golgi'deki işlenme sonucunda Endo H direnci kazanılması, proteinin ilgili Golgi bölgesinden geçtiğini destekler. Duyarlılığın sürmesi tek başına proteinin ER'de kaldığını göstermez. Golgi'de glukozillenme ve Endo H.
Çözümlü problem
Bir salgı proteininin N-ucu sinyal peptidi silinmiş, diğer dizisi korunmuştur. En doğrudan beklenen nedir?
A) Protein zorunlu olarak lizozoma gider B) Kotraslasyonel ER hedeflenmesi bozulabilir C) DNA eşlenmesi durur D) Ribozom oluşmaz E) Protein her koşulda salgılanır.
Yanıt B. Sinyal kaybı ER'ye yönlendirmeyi bozabilir; bazı proteinlerde alternatif hedefleme motifleri bulunabileceği için kesin hücresel yerleşim deneyle gösterilmelidir.
Kaynak yönlendirmesi: OpenStax Biology 2e, bölümler 4.4 ve 15.5; Alberts, protein hedefleme.
İleri uygulama · Hedefleme sinyalini bulmak için deney dizisi
Bir proteinin mitokondri matriksine mi, ER lümenine mi hedeflendiğini yalnız mikroskopta benzer görünümlerle belirlemek güç olabilir. N-ucu sinyal peptidi mutasyonu, floresan etiketin N veya C uca takılması, proteaz-koruma testi ve organel fraksiyonlarının saflığı birlikte kullanılır. Proteaz-koruma deneyinde sağlam organel, proteaz uygulanmış sağlam organel ve proteazla birlikte deterjan uygulanmış organel karşılaştırılır. Organel yüzeyinde proteaza açık bir bölge ilk proteaz koşulunda parçalanabilir. Zarın koruduğu lüminal veya matriks proteini ise ancak zar geçirgenleştirildikten sonra kaybolabilir. Zar bütünlüğü ve proteaz etkinliği bilinen yerleşimli proteinlerle sınanmalıdır. Ancak proteaz duyarlılığı, proteinin katlanması ve zar hasarına bağlıdır. Glukozilasyon durumu ER girişine ilişkin bir ipucu olabilir ama tüm lüminal proteinler aynı şekilde glukozillenmez.
İkinci analitik soru: Pulslama sonrası işaretli protein ER'de t=5 dk 80 birim, t=20 dk 20 birim; Golgi'de sırasıyla 5 ve 40 birim olsun. Bu örüntü ER'den Golgi'ye zamanla ilerleme ile uyumludur. Yalnız iki bölmedeki sinyal değişimiyle tüm moleküllerin doğrudan taşındığı kanıtlanmaz; yıkım, yeniden sentez ve ölçüm verimi ayrıca değerlendirilmelidir.