Alan: Deneysel biyoloji · Düzey: İleri IBO
Ölçüm ilkesi
Belirli bir dalga boyunda ölçülen absorbans ideal çözeltilerde A=εlc ile derişime bağlanabilir. ε molar sönüm katsayısı, l optik yol uzunluğu, c molar derişimdir. Dağılım, bulanıklık, floresans, çok yüksek derişim ve spektral örtüşme bu doğrusal modeli bozabilir. Blank, küvet ve tamponun katkısını düzeltmek için gereklidir. Ölçümün kalibrasyon aralığı dışına taşması durumunda seyreltme veya farklı analiz yapılmalıdır.
NADH'ın 340 nm'de absorbansı, NAD⁺'a göre daha yüksektir ve birçok bağlı enzim testinde kullanılabilir. Ancak testte oluşan/harcanan NADH'ın doğrudan ilgilenilen substrata doğru stokiyometriyle bağlandığı gösterilmelidir. Ayrıca bağlı enzim reaksiyonu hız sınırlayıcı hâle gelirse ölçülen NADH değişimi gerçek hedef enzim hızını temsil etmeyebilir.
Nicel örnek
340 nm'de ölçülen absorbans dakikada 0,124 azalıyor olsun. Yol uzunluğu 1 cm; NADH için ε₃₄₀≈6220 M⁻¹cm⁻¹. |dc/dt|=0,124/6220≈1,99×10⁻⁵ M/dk, yani yaklaşık 19,9 µM/dk. Küvet hacmi 1,0 mL ise NADH tüketim hızı 19,9 nmol/dk'dır. Reaksiyon 1:1 stokiyometriyle eşleniyorsa hedef reaksiyon hızı aynı molar değerde olabilir. Yol uzunluğu değişirse hesap düzeltilmelidir.
Özgün IBO sorusu: A=0,6, ε=6000 M⁻¹cm⁻¹, l=1 cm ise c kaçtır? A) 0,1 µM B) 1 µM C) 10 µM D) 100 µM E) 1 M. Yanıt D. c=0,6/6000=1×10⁻⁴ M=100 µM.
Deney denetimi: Enzim aktivite eğrilerinde ilk doğrusal aralık, blank düzeltmesi ve örneğin zamanla çökelmesi kontrol edilmelidir. Birden fazla dalga boyunda spektrum almak arka plan karışmalarını ayırabilir.
Kaynak: IBO pratik sınav yaklaşımı: https://www.ibo-info.org/en/contest/participation.html
Katı kontrol sonrası derinleştirme
Analitik ölçümde doğrusal aralık ve kör kontrol
Beer–Lambert bağıntısı A=εlc, belirli ışık yolu ve uygun ölçüm koşullarında derişimi absorbansla ilişkilendirir. Saçılma, örnek bulanıklığı, ışık kaçağı, reaksiyon yan ürünleri ve cihazın dinamik aralığı bağıntının yorumunu etkileyebilir. Kör (blank) örnek reaktifler ve çözücü katkısını ölçmeye yardımcı olur; kör düzeltmesi bütün olası parazit etkileri otomatik gidermez.
Bir enzim reaksiyonunda belirli dalga boyundaki absorbansın zamana göre eğimi ölçüldüğünde, absorbansı değiştiren ürün ile diğer bileşenlerin spektral katkıları ayırt edilmelidir. Örneğin dA/dt=0,1244 dk⁻¹, ε=6220 M⁻¹cm⁻¹ ve yol 1 cm ise derişim değişim hızı 0,1244/6220=2,0×10⁻⁵ M/dk olur. Hacim 1 mL ise toplam ürün oluşum hızı 0,020 µmol/dk'dır. Hacim ve yol birimi yanlış dönüştürülürse sonuç çok farklı çıkar.
Yorum sorusu: A>2,0 olan her ölçümü Beer–Lambert doğrusal kabulüyle yorumlamak güvenli midir? Yanıt: Hayır; cihazın doğrusal aralığı doğrulanmalıdır.