Alan: Moleküler biyoloji ve deneysel beceri · Düzey: İleri IBO
Ct sayısı neyi ölçer?
PCR döngüleri primer bağlanması ve DNA polimerazıyla hedef bölgenin çoğaltılmasını içerir. Gerçek zamanlı qPCR'de floresan bir eşik düzeyini geçtiğinde Cq/Ct kaydedilir. Uygun verimle başlayan şablon miktarı büyüdükçe Ct küçülür. Ancak inhibitör varlığı, primer-dimer oluşumu veya farklı amplifikasyon verimi doğrudan karşılaştırmayı bozar. RT-qPCR'de RNA önce ters transkripsiyonla cDNA'ya dönüştürülür; genomik DNA kontaminasyonu RT-negatif kontrolle araştırılır, şablonsuz kontrol ise kontaminasyon ve primer-dimer sinyalini gösterebilir.
ΔΔCt hesabı
ΔCt=Ct_hedef−Ct_referans; ΔΔCt=ΔCt_deney−ΔCt_kontrol. Hedef ve referans için amplifikasyon verimleri birbirine yakın ve her ikisi yaklaşık %100 ise (döngü başına çarpan yaklaşık 2), göreli ifade 2^(−ΔΔCt) ile hesaplanabilir. Kontrol: hedef Ct=24, referans Ct=20 → ΔCt=4. Deney: hedef Ct=22, referans Ct=20 → ΔCt=2. ΔΔCt=−2 ve ifade yaklaşık 4 kattır. Bu değer referansa normalize edilmiş bir kat değişimidir.
Verimler farklıysa
Hedef ve referans için standart eğrinin eğimi m ise döngü başına amplifikasyon çarpanı E=10−1/m olur. Bir hedefin çarpanı Ehedef, referansınki Eref ise normalize oran, EhedefCq(kontrol)−Cq(uygulama) / ErefCq(kontrol)−Cq(uygulama) biçiminde hesaplanabilir. Yukarıdaki örnekte hedef çarpanı 1,90 ve referans Cq değişimi sıfırsa sonuç 1,90²=3,61 kat olur. Seri seyreltmenin doğrusal aralığı, hedefe özgü çoğalma ve referansın kararlılığı ayrıca sınanır. Kaynak · Pfaffl, 2001
Referans geninin bütün uygulamalarda sabit kaldığı varsayımı deneyle değerlendirilmelidir. Gen ifadesinin artması proteinin de aynı oranda arttığını kanıtlamaz: translasyon, protein yıkımı ve hücre içi lokalizasyon ayrı düzenlenir. Teknik tekrar, biyolojik tekrarın yerine geçmez. İstatistiksel birim bağımsız biyolojik örnektir.
Özgün çözüm
Kontrolde hedef Ct=25, referans Ct=20; deneyde hedef Ct=23, referans Ct=21 olsun. Kontrol ΔCt=5; deney ΔCt=2; ΔΔCt=−3; göreli ifade 8 kat. Referans genin deneyde sistematik değiştiği anlaşılırsa bu sonuç yeniden değerlendirilmelidir.
IBO sorusu: 'Deney grubunda Ct iki döngü düştü, dolayısıyla protein miktarı dört kat arttı' çıkarımı neden sorunludur? A) Ct protein miktarını doğrudan ölçer B) Referans ve verim kontrolü gerekir, protein düzeyi ayrıca ölçülmelidir C) qPCR'de DNA yoktur D) Ct her durumda sabittir E) RNA bozulamaz. Cevap B.
Kaynak: MIQE kılavuzu https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19246619/ .